米氏凯伦藻溶血毒素和细胞毒素的分离纯化与毒性研究

【摘要】进入21世纪以来,米氏凯伦藻已成为我国近海,特别是福建省近海域赤潮爆发的主要优势藻种,米氏凯伦藻溶血性毒素(hemolytictoxin)和细胞毒素(cytotoxin)对海洋生物有强烈的毒害作用,严重破坏海洋渔业、水产养殖业的发展,造成了重大的经济损失。为加深对米氏凯伦藻赤潮的认识,了解米氏凯伦藻相关毒素对海洋生物的毒害作用,本研究人工大量培养米氏凯伦藻,在实验室模拟试验米氏凯伦藻对鲍鱼的致死；有机萃取法获得米氏凯伦藻甲醇粗提物,用斑马鱼胚胎的毒性试验,模拟赤潮后期,藻体死亡后,细胞内溶物对海洋生物胚胎和幼体的毒性作用；运用正相硅胶柱、TLC、HPLC等分离纯化方法获得米氏凯伦藻的毒素,研究溶血性毒素的物质结构和溶血活性；通过细胞试验研究米氏凯伦藻细胞毒素对人类肿瘤细胞和鱼类细胞的毒性作用和毒害机制。希望为更加深入研究米氏凯伦藻及赤潮奠定基础。研究结果显示,在实验室模拟自然环境培养米氏凯伦藻,人工培养的密度最高可达5.1×107个/L,超过自然环境下米氏凯伦藻赤潮爆发的最大密度。米氏凯伦藻的鲍鱼喂食实验证明,在藻密度1.0×106个/L及以上时鲍鱼全部死亡。实验证明低浓度米氏凯伦藻甲醇粗提物即抑制斑马鱼胚胎出膜率,半数出膜抑制率浓度为216μg/mL,同时观察到斑马鱼胚胎出现发育迟缓,体节缩短等各种畸形现象。在粗提物浓度超过2.16mg/mL,时,斑马鱼胚胎24小时内致死率达到100%。分离纯化出米氏凯伦藻溶血性毒素化合物MS-2-17,通过质谱和核磁解析,获得溶血性毒素化合物的结构证明它是一种油脂酰胺类化合物,分子量为281.用大白兔的血红细胞做溶血试验验,当化合物浓度在12μg/mL时的溶血活性就能达到80%以上。本研究还分离纯化出米氏凯伦藻细胞毒素的混合物,通过细胞抑制实验、细胞凋亡检测和细胞周期流式检测实验,证明该毒素能够有效抑制HeLa细胞等肿瘤细胞的分裂增殖,当浓度在80ng/mL以内时就能将细胞抑制在G。期内,使细胞不能够进入S期。总之,本研究第一次在实验室模拟米氏凯伦藻赤潮发生前期和后期,证明了鲍鱼摄食米氏凯伦藻细胞可导致死亡,以斑马鱼胚胎为实验对象,率先证明了后期藻体外死亡,低浓度的细胞内溶物对海洋生物胚胎和幼体有很强的生物毒性。成功分离纯化出溶血毒素和鉴定该化合物结构,并进行了溶血活性试验。最先证明米氏凯伦藻细胞毒素能够有效抑制细胞周期的机制。
【作者】郭辉革；
【导师】周化民；陈建明；
【作者基本信息】厦门大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】米氏凯伦藻；溶血性毒素；细胞毒素；斑马鱼胚胎；细胞周期；

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